Les Puces à ADN
Les puces à ADN, ou micromatrices d’ADN sont un des moyens employés afin de diagnostiquer un cancer, rapidement, efficacement et surtout de manière innovante. Ces puces sont capables d’analyser des échantillons infimes d’ADN que les méthodes classiques ne permettent pas d’étudier. Cette biotechnologie va donc permettre d’analyser le niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes transcrit dans une cellule par rapport à un échantillon de référence ( cellule saine ), ce qui va permettre de les comparer et diagnostiquer le cancer en fonction des différences relatives. Ainsi, le génome entier peut être visualisé. Cette technologie repose sur la combinaison de plusieurs domaines, alliant biologie, chimie, nanotechnologie et bioinformatique. Il a donc fallu la collaboration de plusieurs chercheurs de différents secteurs afin de mettre en place les puces à ADN. Ces petits dispositifs qualifiés de laboratoires sur puces vont révolutionner le diagnostic de maladies complexes comme le cancer par exemple.
Les puces à ADN sont le support d’un ensemble de molécules d’ADN que l‘on va fixer sur une plaque de verre (la plupart des cas), de silicium ou de plastique, la mensuration de ces plaques étant de 25x75 mm. Cette fixation est permise par la poly-lysine, polymère qui va maintenir les brins d’ADN via des interactions électrostatiques. Des sondes (séquences d’ADN régulièrement réparties sur la plaque) vont donc être déposés par un robot ( le spotter ) sur des spots contenant la poly-lysine. Les spots (ou dépôts) étant des « trous » réalisés sur la plaque à l’aide d’aiguilles creuses extrêmement petites. Ces trous sont espacés de 250 um (micromètre) et leur diamètre varie de 80 à 300 um. Ainsi, une seule lame peut contenir jusqu’à 15.000 gènes. D’autres lames spécifiques peuvent contenir tout le génome humain ! Soit environ 20.000 gènes. « C'est une révolution technologique : avant on ne pouvait étudier qu'un seul gène à la fois », précise Pascal Soularue, chercheur au Commissariat à l'Energie Atomique (CEA) travaillant au Genopole d'Evry. Depuis quelques années, on a assisté à une véritable révolution liée à cette nouvelle technologie, et les puces à ADN ne cessent d’être améliorées. « Un jour, la puce ne fera qu'un centimètre carré. On déposera une goutte de sang du malade et un lecteur nous donnera toute une batterie de résultats ! » explique Pascal Soularue.
La molécule d'ADN
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est une molécule constituée de deux brins liés entre eux, enroulés en double hélice. Tous deux contiennent au total environ trois milliards de “lettres” chez l'être humain, appelées bases, puisées dans le petit alphabet génétique. Celui-ci ne compte en effet que quatre caractères : A, T, C, G, pour adénine, thymine, cytosine et guanine. Les deux brins d’ADN sont attachés par l'ensemble des associations de deux bases, de façon très spécifique : A avec T et C avec G.
Hybridation
Le principe de l’utilisation des puces à ADN repose sur la capacité qu’ont les brins d’ADN à se rallier à d’autres brins par complémentarité lorsqu’ils sont dénaturés ( séparation des 2 brins d’une molécule d’ADN ), c’est l’hybridation.
Le but de la manœuvre étant de comparer deux séquences d’ADN d’un même type de cellule afin de relever les différences et diagnostiquer le cancer, plusieurs étapes sont nécessaires à la réalisation de cette manipulation. Pour commencer, des molécules d’ADN comportant l’expression des gènes caractéristique du cancer -dont la séquence nucléotidique des gènes est bien sûr connue- sont dénaturées. Ensuite, une molécule fluorescente, verte par exemple, est ajoutée à ces molécules afin de les marquer. Les fragments d’ADN ainsi obtenus sont ensuite déposés sur la plaque à l’aide d’une micropipette robotisée. Les sondes sont alors prêtes.
L’étape suivante consiste à prélever des fragments d’ADN (gènes) de la cellule à analyser, susceptible d’être cancérigène. Les séquences nucléotidiques des gènes à analyser sont en fait d’abord prélevées sous forme d’ARNm (molécule dérivée de l’ADN véhiculant l’information génétique du noyau de la cellule au lieu de synthèse des protéines, c’est donc le reflet de l’expression des gènes à un instant donné), puis sont transcrites en ADN ( c'est la rétrotranscription ) à l’aide d’une enzyme spécifique : la transcriptase inverse. Lors de cette rétrotranscription, une molécule fluorescente, rouge par exemple, est ajoutée aux nucléotides à analyser, afin d’obtenir des marqueurs biologiques. Les fragments à analyser, ou cibles, sont alors prêts à leur tour, après avoir été dénaturés.
Vient alors le moment de mettre en contact les sondes et les cibles précédemment préparées. Les oligonucléotides des cibles ont la faculté de s’accrocher aux oligonucléides des sondes qui leur sont complémentaires. Cette faculté repose sur une caractéristique de l’ADN : deux brins d’ADN complémentaires l’un de l’autre (complémentarité des 4 bases A-T, G-C) peuvent s’hybrider, comme nous l’avons vu, et former un ADN à double brin. La plaque, support des spots couplés avec les cibles est alors prête. La puce à ADN a été créée.
Le but de la manœuvre étant de comparer deux séquences d’ADN d’un même type de cellule afin de relever les différences et diagnostiquer le cancer, plusieurs étapes sont nécessaires à la réalisation de cette manipulation. Pour commencer, des molécules d’ADN comportant l’expression des gènes caractéristique du cancer -dont la séquence nucléotidique des gènes est bien sûr connue- sont dénaturées. Ensuite, une molécule fluorescente, verte par exemple, est ajoutée à ces molécules afin de les marquer. Les fragments d’ADN ainsi obtenus sont ensuite déposés sur la plaque à l’aide d’une micropipette robotisée. Les sondes sont alors prêtes.
L’étape suivante consiste à prélever des fragments d’ADN (gènes) de la cellule à analyser, susceptible d’être cancérigène. Les séquences nucléotidiques des gènes à analyser sont en fait d’abord prélevées sous forme d’ARNm (molécule dérivée de l’ADN véhiculant l’information génétique du noyau de la cellule au lieu de synthèse des protéines, c’est donc le reflet de l’expression des gènes à un instant donné), puis sont transcrites en ADN ( c'est la rétrotranscription ) à l’aide d’une enzyme spécifique : la transcriptase inverse. Lors de cette rétrotranscription, une molécule fluorescente, rouge par exemple, est ajoutée aux nucléotides à analyser, afin d’obtenir des marqueurs biologiques. Les fragments à analyser, ou cibles, sont alors prêts à leur tour, après avoir été dénaturés.
Vient alors le moment de mettre en contact les sondes et les cibles précédemment préparées. Les oligonucléotides des cibles ont la faculté de s’accrocher aux oligonucléides des sondes qui leur sont complémentaires. Cette faculté repose sur une caractéristique de l’ADN : deux brins d’ADN complémentaires l’un de l’autre (complémentarité des 4 bases A-T, G-C) peuvent s’hybrider, comme nous l’avons vu, et former un ADN à double brin. La plaque, support des spots couplés avec les cibles est alors prête. La puce à ADN a été créée.
Lecture des spots
Cette même puce est alors photographiée par un scanner muni de lasers qui vont exciter les molécules fluorescentes, ce qui permettra une détection du signal émis par chaque spot (point de la plaque) à l’aide d’un microscope confocal (microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ de l’ordre du nanomètre). Nous obtenons alors une image numérique de la puce, avec des spots plus ou moins verts ou rouges en fonction de l’intensité de la fluorescence des molécules affiliées aux oligonucléotides. Ainsi, la couleur de chaque spot (dépôt où le gène est fixé) varie du rouge au vert, la couleur est déterminée par un logiciel.Pour cela, on mesure la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome vert et la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome rouge. Puis on normalise ces quantités en fonction de divers paramètres (puissance d'émission de chaque fluorochrome, ...). On suppose alors que la quantité d'ADN fluorescent fixée sur les sondes est proportionnelle à la quantité d'ADN correspondant dans la cellule à analyser et on calcule le ratio fluorescence rouge / fluorescence verte. Si ce ratio est supérieur à 1 (rouge sur l'image), le gène est plus exprimé dans la seconde culture, si ce ratio est inférieur à 1 (vert sur l'image), le gène est moins exprimé dans la seconde culture. Lorsque le spot est rouge, c'est que le gène est réprimé (n'est plus exprimé). Lorsqu’il est vert, c'est que le gène est sur-exprimé. S'il est jaune sur l'image, cela signifie que l'expression du gène est inchangée. Nous pouvons alors détecter la présence de gènes « déficients », absents ou en trop et diagnostiquer un cancer ou une autre maladie (à partir des cancers et maladies déjà connus et fichés).
Problèmes
L'utilisation des puces à ADN est sans doute formidable et permettrait de changer un grand nombre de choses dans le domaine génétique. Cependant, quelques petits problèmes semblent freiner cette course à laquelle participent les chercheurs afin de développer le plus rapidement la puce révolutionnaire, infaillible et et surtout fonctionnelle.
Les problèmes relatifs à cette technologie sont de trois ordres principaux :
Les puces à ADN permettent de visualiser par fluorescence quels gènes sont exprimés et avec quelle intensité. Seul bémol : une grande part de la lumière fluorescente est piégée dans le substrat ( sondes ), support sur lequel sont déposées les cibles ADN. Les gènes très faiblement exprimés peuvent donc rester invisibles ! Pour pallier cet inconvénient, les chercheurs ont mis au point une lame de verre spécialement conçue pour renvoyer plus de lumière vers le détecteur et ainsi augmenter sa sensibilité afin de repérer tous les signaux émis par les molécules fluorescentes, même les plus infimes.
Les problèmes relatifs à cette technologie sont de trois ordres principaux :
- la concentration d'ARNm n'est pas nécessairement représentative de l'activité du gène correspondant, il est donc difficile de déterminer si un gène est vraiment sur-exprimé ou pas
- la fabrication d'une puce à ADN est un processus cher ( du moins à ses débuts ) et nécessite un matériel technologiquement avancé pour la recherche, donc très onéreux
- le génome entier de l'organisme étudié doit être complètement séquencé et la fonction des gènes n'est pas encore suffisamment connue (notons que nous ne connaissons la fonction que de 15% du génome humain)
Les puces à ADN permettent de visualiser par fluorescence quels gènes sont exprimés et avec quelle intensité. Seul bémol : une grande part de la lumière fluorescente est piégée dans le substrat ( sondes ), support sur lequel sont déposées les cibles ADN. Les gènes très faiblement exprimés peuvent donc rester invisibles ! Pour pallier cet inconvénient, les chercheurs ont mis au point une lame de verre spécialement conçue pour renvoyer plus de lumière vers le détecteur et ainsi augmenter sa sensibilité afin de repérer tous les signaux émis par les molécules fluorescentes, même les plus infimes.
L'utilisation des puces à ADN est sans doute formidable et permettrait de changer un grand nombre de choses dans le domaine génétique. Cependant, quelques petits problèmes semblent freiner cette course à laquelle participent les chercheurs afin de développer le plus rapidement la puce révolutionnaire, infaillible et et surtout fonctionnelle.
Les problèmes relatifs à cette technologie sont de trois ordres principaux :
Les puces à ADN permettent de visualiser par fluorescence quels gènes sont exprimés et avec quelle intensité. Seul bémol : une grande part de la lumière fluorescente est piégée dans le substrat ( sondes ), support sur lequel sont déposées les cibles ADN. Les gènes très faiblement exprimés peuvent donc rester invisibles ! Pour pallier cet inconvénient, les chercheurs ont mis au point une lame de verre spécialement conçue pour renvoyer plus de lumière vers le détecteur et ainsi augmenter sa sensibilité afin de repérer tous les signaux émis par les molécules fluorescentes, même les plus infimes.
Les problèmes relatifs à cette technologie sont de trois ordres principaux :
- la concentration d'ARNm n'est pas nécessairement représentative de l'activité du gène correspondant, il est donc difficile de déterminer si un gène est vraiment surexprimé ou pas
- la fabrication d'une puce à ADN est un processus cher ( du moins à ses débuts ) et nécessite un matériel technologiquement avancé pour la recherche, donc très onéreux
- le génome entier de l'organisme étudié doit être complètement séquencé et la fonction des gènes suffisamment connue (notons que nous ne connaissons la fonction que de 15% du génome humain)
Les puces à ADN permettent de visualiser par fluorescence quels gènes sont exprimés et avec quelle intensité. Seul bémol : une grande part de la lumière fluorescente est piégée dans le substrat ( sondes ), support sur lequel sont déposées les cibles ADN. Les gènes très faiblement exprimés peuvent donc rester invisibles ! Pour pallier cet inconvénient, les chercheurs ont mis au point une lame de verre spécialement conçue pour renvoyer plus de lumière vers le détecteur et ainsi augmenter sa sensibilité afin de repérer tous les signaux émis par les molécules fluorescentes, même les plus infimes.